تحسين ظروف التفاعل لتحقيق عائد عالي من ستيفيا ريبوديوسايد D
أدت الأنظمة الغذائية عالية السكر إلى زيادة انتشار العديد من الأمراض المزمنة، بما في ذلك السمنة، والسكري، وأمراض القلب والأوعية الدموية، وارتفاع ضغط الدم، مما يشكل قلقا عالميا كبيرا بشأن الصحة العامة. ستيفيا ريبوسيد دي (Reb D)، محلي طبيعي مشتق من النباتات، حظي باهتمام كبير كبديل للسكر بسبب محتواه الخالي من السعرات الحرارية، وحلاوته الشديدة، وملفه اللذيذ في الطعم.
ومع ذلك، فإن وجودها المحدود في ستيفيا ريبوديانا بيرتوني والتحديات المتعلقة بانخفاض الذوبان والنشاط الإنزيمي لإزيمات الجليكوزيل ترانسفيراز المستخرج من النباتات أعاقت تطبيقه التجاري الواسع. استجابة لهذه المشاكل، تم اكتشاف جليكوسيل ترانسفيراز جديد يسمى YojK، نشأ من Bacillus subtilis 168. تقدم هذه الدراسة جليكوزيل ترانسفيراز بكتيري معدل وراثيا، YojK-I241T/G327N، يتميز بذوبانيته العالية وكفاءة حفازية، مما يوفر إمكانات كبيرة لإنتاج Reb D على نطاق صناعي.
تطوير طريقة عالية الكفاءة لإنتاج ريبوديوسايد D باستخدام تفاعل متدرج بين إنزيمات YojK-I241T/G327N وAtSuSy.
لمعالجة مشكلة انخفاض الذوبانية في الجليكوزيل ترانسفيراز المشتقة من النباتات، بحث الباحثون في إمكانية استخدام YojK، وهو إنزيم O-جليكوزيل ترانسفيراز من Bacillus subtilis 168. تم اختيار YojK بسبب نشاطه المثبت في الجليكوزيل مع ركائز مختلفة، بما في ذلك جزيئات كبيرة. بعد نجاح التعبير والتنقية المعاد تركيبها، تم استخدام YojK لجليكوزيلين Reb A، مما أدى إلى إنتاج Stevia Reb D. كشف تحليل الإنزيمات الحركية أن YojK لديه نشاط حفاز أقل نحو Reb D مقارنة بأنواع الجليكوزيل ترانسفيراز الأخرى. وبالتالي، تشير الدراسة إلى ضرورة الهندسة الموجهة بالهياكل لتعزيز النشاط التحفيزي لبرنامج YojK لتطبيقات عملية محتملة. (كما هو موضح في الشكل 1)
الشكل 1
تحسين ظروف التفاعل لتحقيق عائد عالي من ريبوديوسايد D.
يمكن تحسين ظروف التفاعل، بما في ذلك الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتركيز الركيزة، لتحقيق عائد عالي من Srevia Reb D. استخدمت الدراسة محاكاة الديناميكا الجزيئية لدراسة كيفية تعزيز متغير YojK-I241T/G327N لزيادة جليكوزلة Reb D. حافظ المتغير على رابطة هيدروجينية مستقرة بين Reb A و H14 أثناء المحاكاة، على عكس النوع البري (كما هو موضح في الشكل 2). امتد هذا الاستقرار أيضا إلى المسافة بين ذرة O2 للرب أ وذرة C1P في UDPG. وقد نسب تحسين كفاءة التحفيز في نسخة YojK-I241T/G327N إلى هذه التفاعلات المستقرة، مما يشير إلى إمكاناته العملية.
الشكل 2
الشكل 3
الخاتمة
وقد حقق هذا النهج نسبة 83.47٪ من ريبيوم D. ومن الجدير بالذكر أن إضافة 1 ملليمولار UDPG سمحت بتخليق 20.59 جم/لتر Reb D بعائد مذهل بلغ 91.29٪، متجاوزا الدراسات السابقة. تظهر هذه العملية الإمكانات لإنتاج Reb D على نطاق صناعي، خاصة بعد الهندسة الإنشائية ليوجوك كينغ.يمكن التعبير عن YojK بكفاءة في E. coli BL21 (DE3) بذوبانية عالية. من خلال الهندسة الموجهة بالهيكل، تم إنشاء طفرة مزدوجة باسم YojK-I241T/G327N، مما مكن من إنتاج Reb D على نطاق واسع بعائد استثنائي يبلغ 91.29٪ من خلال إعادة تدوير UDPG المحفز بواسطة إنزيم السكروز السينثاز AtSuSy. تقدم هذه الدراسة YojK-I241T/G327N كأداة واعدة لإنتاج Reb D الصناعي الفعال اقتصاديا.
