قياس NAD+ ومستقلباته في الأعصاب الوركية للفئران
مقدمة
تم التعرف على نطاق واسع على الأجزاء الحاسمة من ثنائي نوكليوتيد الأدينين والنيكوتيناميد (NAD+) ومستقلباته في الشيخوخة والتنكس العصبي. لتحفيز التقدم نحو البحث الكيميائي الحيوي والتدخلات التي تستهدف الشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية، من الأهمية بمكان تحديد كمية NAD+ ومستويات مستقلباته في مسار إنقاذ NAD+ بدقة. هنا، يتم تطبيق طريقة LC-MS/MS قوية ودقيقة لتحديد كمية NAD+ ومستويات مستقلباته في العصب الوركي للفأر الطبيعي والمصاب.قيود الطرق الحالية لتحديد كمية NAD+ ومستقلباته
تواجه الطرق التقليدية لتحديد كمية NAD+ ومستقلباته، مثل HPLC-UV، NMR، الفصل الكهربائي الشعري، أو المقايسات الأنزيمية اللونية، تحديات مختلفة في الحساسية والانتقائية والقياس غير المباشر. بالنسبة لمقايسات LC-MS/MS الحالية لقياسات NAD+ ومستقلباته في الخلايا أو الأنسجة، لا تزال هناك العديد من الصعوبات التي يجب التغلب عليها، مثل أوقات التشغيل الطويلة، وسلوك الاحتفاظ الكروماتوغرافي الضعيف، وأشكال القمم غير المرضية. علاوة على ذلك، يمكن لهذه الطرق تغطية مادة إلى ثلاث مواد فقط في مسار إنقاذ NAD+.تعديلات طريقة LC-MS/MS
على أساس مقايسات LC-MS/MS الحالية، يتم إجراء تعديلات على الظروف الكروماتوغرافية، والمصفوفة البديلة، وظروف MS/MS. على وجه التحديد، يتم استخدام 5 ميكرومتر من حمض الميثيلين الفوسفونيك كمادة مضافة للطور المتحرك، مما يعزز بشكل صريح شدة الإشارة وشكل القمة. نظرًا للطبيعة النظيفة والبسيطة نسبيًا للعينات وحجمها الصغير، يتم اختبار الماء فائق النقاء كمصفوفة بديلة. بدلاً من عمود الكروماتوغرافيا السائلة للتفاعل المحب للماء وعمود الكربون الفائق، يتم استخدام عمود Waters Atlantis Premier BEH C18 AX، الذي تتيح تقنية MaxPeak HPS عالية الأداء الفريدة (التي تخمل الجدار الداخلي للعمود، وتزيل السطح المعدني) استنساخًا عاليًا، وتماثلًا في القمم، وفصلًا أساسيًا لجميع المحللات.بالإضافة إلى ذلك، يتم تحسين ظروف MS لتقليل إشارة تداخل NAD+ في قناة الأدينوسين ثنائي فوسفات الريبوز الحلقي (cADPR) مع الحفاظ على استجابة cADPR وأحادي نوكليوتيد النيكوتيناميد (NMN)، مع 4000 فولت لجهد رذاذ الأيونات، و450 درجة مئوية لدرجة حرارة السخان التوربيني، و50 رطل لكل بوصة مربعة للغاز 1، و50 رطل لكل بوصة مربعة للغاز 2، و30 رطل لكل بوصة مربعة لغاز الستارة، و12 رطل لكل بوصة مربعة لغاز التصادم.
كروماتوجرام تمثيلي لعينات الأعصاب (طبيعية مقابل مصابة)
تحقق جميع المحللات الخمسة فصلًا أساسيًا، حيث أن cADPR هو علامة حيوية حساسة في نموذج التنكس العصبي. هنا، يؤدي قطع العصب الوركي إلى تنكس محوري، مما يؤدي إلى انخفاض مستوى NAD+ وارتفاع مستوى NMN في الأعصاب المصابة، مما يؤدي إلى زيادة حوالي ضعفين في نسبة NMN/NAD+. في الوقت نفسه، تنخفض مستويات النيكوتيناميد (NAM) والأدينوسين ثنائي فوسفات الريبوز (ADPR) بحوالي ضعفين، بينما يزداد مستوى cADPR بأكثر من 8 أضعاف. تتوافق هذه النتائج مع نتائج الأبحاث المنشورة سابقًا، مما يتحقق من دقة طريقة LC-MS/MS المعدلة هذه في تحديد كمية NAD+ ومستقلباته.
الخلاصة
تتيح طريقة LC-MS/MS المعدلة هذه فصلًا أساسيًا فعالًا لـ NAD+ وNMN وNAM وADPR وcADPR خلال وقت تشغيل قصير يبلغ 5 دقائق، مما يساهم في التشخيص المبكر للاضطرابات العصبية المختلفة وتطوير الأدوية للشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية.المراجع
Ma Y, Deng L, Du Z. تطوير والتحقق من طريقة LC-MS/MS لتحديد كمية NAD+ والمستقلبات ذات الصلة في الأعصاب الوركية للفئران وتطبيقها على نموذج حيواني لإصابة الأعصاب. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
بونتاككرست نفسها للبحث والتطوير والتصنيع وبيع المواد الخام للإنزيمات المساعدة والمنتجات الطبيعية منذ عام 2012، مع مصانع مملوكة ذاتيًا، وأكثر من 170 براءة اختراع عالمية بالإضافة إلى فريق بحث وتطوير قوي. تمتلك BONTAC خبرة بحثية غنية وتقنية متقدمة في التخليق الحيوي لـNAD وسلائفه(مثل NMN وNR). هناك أنواع مختلفة من NAD للاختيار من بينها، بما في ذلك NAD من الدرجة ER (إزالة الإندوتوكسين)، وNAD من الدرجة الأولى (مسحوق خام للاستخدام في التشخيص المخبري/المكملات الغذائية/مستحضرات التجميل)، وNAD من الدرجة الثانية (API/وسيطة) وNAD من الدرجة الرابعة (إذا كانت هناك متطلبات أعلى على قابلية الذوبان)، والتي يمكن توفيرها في شكل مسحوق مجفف بالتجميد أو مسحوق بلوري. يمكن أن تصل نقاوة NAD من BONTAC إلى أكثر من 98%.
