قياس كمية NAD+ ومستقلباتها في أعصاب الورك الفأرية
مقدمة
تم الاعتراف على نطاق واسع بالأجزاء الحيوية من نيكوتيناميد أدينين ثنائي نيوكليوتيد (NAD+) ومستقلباته في مرحلة الشيخوخة والتنكس العصبي. ولتحفيز التقدم نحو البحث الكيميائي الحيوي والتدخلات التي تستهدف الشيخوختة والأمراض التنكسية العصبية، من المهم جدا قياس NAD+ ومستويات الأيض الخاص به بدقة في مسار الإنقاذ NAD+. هنا، يتم تطبيق طريقة متينة ودقيقة ل LC-MS/MS لقياس مستويات NAD+ ومستويات مستقلباته في العصب الوركي الفأر الطبيعي والمصاب.قيود الطرق الحالية لقياس NAD+ ومستقلباتها
تواجه الطرق التقليدية لقياس NAD+ ومستقلبيه، مثل HPLC-UV، NMR، الرحلان الكهربائي في منطقة الشعيرات الدموية، أو اختبارات إنزيمات لونية، تحديات متنوعة في الحساسية والانتقائية والقياس غير المباشر. أما بالنسبة لاختبارات LC-MS/MS الحالية لقياسات NAD+ الخلوية أو الأنسجة وقواعدها الغذائية، فلا تزال هناك العديد من الصعوبات التي يجب التغلب عليها، مثل فترات التشغيل الطويلة، وسلوك احتفاظ كروماتوغرافي ضعيف، وأشكال الذروة غير المرضية. علاوة على ذلك، يمكن تغطية مادة واحدة إلى ثلاث فقط في مسار الإنقاذ NAD+ بهذه الطرق.تعديلات طريقة LC-MS/MS
On the basis of existing LC-MS/MS assays, the modifications regarding the chromatographic conditions, surrogate matrix and MS/MS conditions are conducted. Specifically, 5 μM of methylene phosphonic acid is employed as the mobile phase additive, which explicitly promotes the signal intensity and peak shape. Given the relatively clean and simple nature of never samples and their small size, ultrapure water is tested as a substitute matrix. Instead of hydrophilic interaction liquid chromatography column and hypercarb column, the Waters Atlantis Premier BEH C18 AX column is utilized, whose unique MaxPeak HPS high-performance surface technology (passivating the column inner wall, eliminating metal surface) enables the high reproducibility, peak symmetry, and baseline separation of all analytes. بالإضافة إلى ذلك، تم تحسين ظروف MS لتقليل إشارة التداخل NAD+ في قناة ريبوز الأدينوزين ثنائي الفوسفات الدوري (cADPR) مع الحفاظ على استجابة cADPR ونيكوتيناميد مونوكليوتيد (NMN)، مع 4000 فولت لجهد رش الأيونات، 450°C لدرجة حرارة سخان التوربو، 50 psi للغاز 1، 50 psi للغاز 2، 30 psi للغاز الستاري، و12 psi لغاز التصادم.
كروماتوجرام ممثل لعينات الأعصاب (طبيعي مقابل مصاب)
جميع المحللات الخمسة تحقق انفصالا أساسيا، حيث يعد cADPR علامة حيوية حساسة في نموذج التنكس العصبي. هنا، يؤدي قطع العصب الوركي إلى تحفيز تنكس المحور، مما يؤدي إلى انخفاض مستوى NAD+ وارتفاع مستوى NMN في الأعصاب المصابة، مما يؤدي إلى زيادة حوالي مرتين في نسبة NMN/NAD+. في الوقت نفسه، تنخفض مستويات النيكوتيناميد (NAM) وريبوز الأدينوزين ثنائي الفوسفات (ADPR) بحوالي مرتين، بينما يرتفع مستوى cADPR بأكثر من 8 أضعاف. تتوافق هذه النتائج مع تلك التي أجريت سابقا في الأبحاث المبلغ عنها، مما يؤكد دقة هذه الطريقة المعدلة ل LS-MS/MS في قياس NAD+ ومستقلبياته.
الخاتمة
تمكن هذه الطريقة المعدلة من LC-MS/MS الفصل الأساسي الفعال بين NAD+، NMN، NAM، ADPR، وcADPR خلال فترة قصيرة تبلغ 5 دقائق، مما يساهم في التشخيص المبكر لاضطرابات عصبية مختلفة وتطوير الأدوية للشيخوخة والأمراض التنكسية العصبية.المرجع
ما ي، دينغ إل، دو ز. تطوير والتحقق من طريقة LC-MS/MS لقياس NAD+ والمستقلبات المرتبطة بها في الأعصاب الوركي في الفئران وتطبيقها على نموذج حيواني متعرض لإصابات الأعصاب. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821بونتاك ناد
بونتاك كرست جهودها للبحث والتطوير، وتصنيع وبيع المواد الخام للكوإنزيم والمنتجات الطبيعية منذ عام 2012، مع مصانع مملوكة لذاتها، وأكثر من 170 براءة اختراع عالمية، بالإضافة إلى فريق بحث وتطوير قوي. تمتلك بونتاك خبرة غنية في البحث والتطوير وتقنيات متقدمة في التخليق الحيوي NAD وسابقاته (مثلا. NMN وNR). هناك أنواع مختلفة من NAD يجب اختيارها، تشمل درجة NAD ER (إزالة الإندوكسين)، NAD الدرجة الأولى (IVD/مكملات غذائية/مسحوق مستحضرات التجميل الخام)، NAD الدرجة الثانية (API/الوسطيات) وNAD الدرجة الرابعة (إذا كان هناك متطلبات أعلى للذوبانية)، والتي يمكن توفيرها على شكل مسحوق ليوفيليا أو مسحوق بلور. يمكن أن تصل نقاء بونتاك ناد إلى أكثر من 98٪.
