هندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو من خلال التلاعب بتجديد العامل المساعد للأكسدة والاختزال

يتم الآن إنتاج مجموعة متزايدة باستمرار من المواد الكيميائية من المواد الأولية المتجددة عبر الوسائل التكنولوجية الحيوية. تعتمد العمليات الحيوية بشكل كبير على التحفيز الإنزيمي للإنتاج الفعال لهذه المركبات. لذلك، فإن ضمان أداء الإنزيمات على النحو الأمثل في البيئة المطلوبة له أهمية كبيرة للإنتاج المستدام.

تعد خصائص مثل خصوصية الركيزة، ومعدل التحفيز، والاستقرار (الحراري) من بين عدة عوامل حاسمة يجب تحسينها لعمليات حيوية فعالة تعتمد على الإنزيمات. يمكن أن يكون هذا التحسين مستهلكًا للوقت ومكلفًا وصعبًا، وبالتالي فإن الطرق الفعالة والفعالة من حيث التكلفة للاختيار المقترن بالنمو، وهندسة الإنزيمات ذات الخصائص المرغوبة مطلوبة بشدة.

مزايا استخدام الاختيار المقترن بالنمو كشكل من أشكال اختيار الإنزيمات، والذي يتضمن ربط نشاط الإنزيم بنمو الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة كاستراتيجية اختيار عالية الإنتاجية، ويمكن تحقيقها إما بضمان أن النمو يعتمد على تخليق المنتج بواسطة الإنزيم المستهدف أو بربط نشاط الإنزيم بحالة الطاقة العالمية للخلية. يمكن استخدام البيولوجيا التركيبية لهندسة سلالات مناسبة للاختيار المقترن بالنمو، وقد ركزت التطورات الحديثة على هندسة سلالات تعاني من نقص في الحالات المؤكسدة أو المختزلة لأزواج العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال، والتي يمكن أن تكون بمثابة منصات لهندسة الإنزيمات. قد يؤدي استخدام هذه المنصات إلى تسريع تطوير محفزات حيوية وعمليات حيوية محسنة.

فوائد الاقتران بالنمو عبر عوز العامل المساعد

فوائد استخدام عوز العامل المساعد كطريقة اختيار لهندسة الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي لبعض المواد الكيميائية، مثل الدهون والوقود الحيوي والغازات والمذيبات العضوية أو المركبات البوليمرية. يقدم هذا النهج العديد من الفوائد الفريدة، بما في ذلك القدرة على الاختيار للمنتج المطلوب بشكل مستقل عن الركيزة أو المنتج محل الاهتمام، مما يسهل اكتشاف النشاط الإنزيمي المحسن، ويوفر قراءة لاكتشاف النشاط الإنزيمي المحسن. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام الكائنات ذات العوز المساعد كمنصات اقتران بالنمو مفيد لأن الطبيعة الواسعة الانتشار للعوامل المساعدة للأكسدة والاختزال في التمثيل الغذائي الميكروبي تعني أن استراتيجيات الهندسة يمكن نقلها جانبيًا إلى ميكروبات أخرى محل الاهتمام، ويمكن هندسة الإنزيمات مباشرة داخل بيئة المضيف الميكروبي المطلوب. (كما هو موضح في الشكل 1)

الشكل 1: مقارنة بين العديد من تقنيات الفحص/الاختيار المستخدمة على نطاق واسع لهندسة الإنزيمات

الطفرات المعيبة في أكسدة NADH

يمكن أن تحدث أكسدة NADH في الإشريكية القولونية عبر مسارين، اعتمادًا على توافر الأكسجين. في الظروف الهوائية، يتأكسد NADH بشكل رئيسي من خلال التنفس لتوليد ATP، بينما في الظروف اللاهوائية، يمكن أن يتأكسد من خلال مسارات التخمر لإنتاج اللاكتات والإيثانول. تم استخدام سلالات متحولة من الإشريكية القولونية، غير القادرة على استخدام مسارات التخمر المختلطة لأكسدة NADH أثناء النمو اللاهوائي، لدفع مسارات أكسدة NADH للتخليق اللاهوائي لمختلف المواد الكيميائية، مثل 2-ميثيل بروبان-1-أول، و2،3-بوتانديول، و1-بوتانول، وL-ألانين. كما تم استخدام هذه السلالات المتحولة لهندسة الإنزيمات من خلال استغلال مبادئ الأكسدة والاختزال المماثلة، مما أدى إلى متغيرات محسنة. يمكن استخدام السلالات الناتجة لهندسة الإنزيمات والمسارات الأخرى المعتمدة على NAD(P)H.

الطفرات المعيبة في اختزال NAD+

أنشأ وينك وآخرون سلالة من الإشريكية القولونية عن طريق حذف جين ثنائي هيدروليبويل ديهيدروجينيز (lpd)، مما أدى إلى عدم قدرة السلالة على توليد قوة الاختزال (NADH وNADPH) من استقلاب الأسيتات بسبب غياب نشاط نازعة هيدروجين البيروفات. تسبب هذا في إظهار السلالة لعوز في قوة الاختزال عند نموها هوائيًا على الأسيتات كمصدر وحيد للكربون. (كما هو موضح في الشكل 2) كانت السلالة قادرة على النمو على الأسيتات عند إضافة ركائز تحلل السكر العلوية أو عند التعبير عن نازعات هيدروجين الفورمات أو الإيثانول أو الميثانول المعتمدة على NAD+ مع ركائزها الخاصة. لم يتم استخدام السلالة لهندسة الإنزيمات وتم تقييمها فقط لعوز العامل المساعد للأكسدة والاختزال.
 

الشكل 2: التمثيل الغذائي المركزي

الطفرات المعيبة في أكسدة NADPH

هناك استراتيجيتان مختلفتان لتحفيز عوز NADP+ في الإشريكية القولونية، بالاعتماد على هندسة مسار تحلل السكر للإفراط في إنتاج NADPH. تتضمن الاستراتيجية الأولى حذف الجين الأصلي gapA والتعبير عن إنزيم GAPDH غيري المعتمد على NADP+، بينما تتضمن الاستراتيجية الثانية إعادة توجيه تدفق الكربون عبر مسار فوسفات البنتوز. السلالات الناتجة غير قادرة على النمو على الجلوكوز ولكنها تظهر نموًا في ظروف مختلفة، حيث تنمو السلالة الأولى في ظروف لاهوائية والثانية في ظروف هوائية مع الجلسرين كركيزة. تُستخدم هذه السلالات لهندسة الإنزيمات ذات الخصائص المحسنة، بما في ذلك خصوصية الركيزة والنشاط التحفيزي والاستقرار الحراري.

الطفرات المعيبة في اختزال NADP+

تم هندسة ثلاث بكتيريا مختلفة، الإشريكية القولونية، الزائفة الزنجارية، والوتدية الغلوتامية، لتكون عوزًا لـ NADPH، مما يعني أنها تتطلب NADPH خارجيًا للنمو. في حالة الإشريكية القولونية والوتدية الغلوتامية، تم حذف إنزيمات التمثيل الغذائي المركزي لتجنب اختزال NADP+ عند توفير الجلوكوز كمصدر للكربون، بينما في الزائفة الزنجارية، تم استخدام الهندسة بمساعدة CRISPR/nCas9 لتعطيل مجموعات من الجينات المستهدفة بشكل تسلسلي لفهم مشاركتها في استقلاب الأكسدة والاختزال. تم بعد ذلك استخدام السلالات العوزة لـ NADPH لهندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو بناءً على خصوصية العامل المساعد. أسفرت جولة واحدة من الطفرات باستخدام الإشريكية القولونية عن أكثر نازعة هيدروجين الفورمات المعتمدة على NADP+ كفاءة وخصوصية حتى الآن، بينما تمثل الزائفة الزنجارية والوتدية الغلوتامية أول سلالات من نوعها يمكن استخدامها لهذا النوع من الهندسة.

الطفرات المعيبة في اختزال NMN+

تم تطوير نظام اقتران نمو لربط تدوير العوامل المساعدة بالنمو بناءً على نقص في اختزال NMN+. تم استخدام سلالة E. coli SHuffle، التي تحمل حذفًا في جينين يشاركان في إنتاج الجلوتاثيون المختزل. تم تطوير إنزيم اختزال الجلوتاثيون المعتمد على NMNH من خلال الطفرات العقلانية لربط العملية بدورة NMN+/NMNH، وتم استخدام إنزيم نازعة هيدروجين الجلوكوز المعتمد على NMN+ لدعم تدوير العامل المساعد NMN+/NMNH وبالتالي النمو. كما طبقت الدراسة لأول مرة الاعتماد الغذائي على العامل المساعد غير التقليدي للأكسدة والاختزال في هندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو، مما أسفر عن متغير من إنزيم نازعة هيدروجين الفوسفيت الثابت حرارياً بتحسن في الكفاءة التحفيزية والاستقرار الزمني في المختبر. يوفر العمل سلالة مفيدة لهندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو، تعتمد على دورة NMN+/NMNH وتتطلب الحالة المختزلة لعامل مساعد غير تقليدي للأكسدة والاختزال.

إن إمكانات الاقتران بالنمو عبر العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال عملت كأداة قوية لهندسة المحفزات الحيوية، خاصة في سياق الإنتاج الحيوي المستدام. على الرغم من إحراز تقدم كبير في توليد سلالات تعتمد غذائيًا على العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال، يشير البيان إلى أنه لا تزال هناك عدة مسارات بحثية غير مستكشفة. أحدها يتضمن هندسة سلالات معتمدة غذائيًا على العوامل المساعدة لكائنات أخرى غير الإشريكية القولونية، مما قد يفتح إمكانيات جديدة لهندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو.

بشكل عام، يشير ذلك إلى أن استخدام الاقتران بالنمو القائم على العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال يمثل فرصة كبيرة لهندسة التحفيز الحيوي، خاصة لإنتاج منتجات لا يمكنها تلبية متطلبات مناهج هندسة الإنزيمات عالية الإنتاجية الأخرى. ويؤكد على الحاجة إلى تطوير محفزات حيوية أكثر تنوعًا وكفاءة للإنتاج الحيوي المستدام ويبرز أهمية استمرار البحث في هذا المجال.


المرجع: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, هندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو من خلال التحكم في تجديد العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال, Biotechnology Advances, 2023.