هندسة الإنزيم المقترن بالنمو من خلال التلاعب بتجديد العامل المساعد للأكسدة والاختزال

ويجري الآن إنتاج طائفة متزايدة الاتساع من المواد الكيميائية من المواد الأولية المتجددة من خلال وسائل التكنولوجيا الأحيائية. تعتمد العمليات الحيوية بشكل كبير على التحفيز الأنزيمي لإنتاج هذه المركبات بكفاءة. لذلك فإن ضمان أداء الإنزيمات على النحو الأمثل في بيئتها المطلوبة له أهمية كبيرة للإنتاج المستدام.

تعد الخصائص مثل خصوصية الركيزة والمعدل الحفاز والاستقرار (الحراري) من بين العديد من العوامل الحاسمة التي يجب تحسينها من أجل العمليات الحيوية الفعالة التي يحركها الإنزيم. يمكن أن يكون هذا التحسين مضيعة للوقت ومكلفا وصعبا ، وبالتالي فإن الطرق الفعالة والفعالة من حيث التكلفة التي من المحتمل أن تكون للاختيار المقترن بالنمو ، والإنزيمات الهندسية ذات الخصائص المرغوبة مطلوبة للغاية.

مزايا استخدام الانتقاء المقترن بالنمو كشكل من أشكال الانتقاء الإنزيمي، الذي يتضمن ربط نشاط الإنزيم بنمو الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة كاستراتيجية اختيار عالية الإنتاجية ، ويمكن تحقيقها إما عن طريق ضمان اعتماد النمو على تخليق المنتج بواسطة الإنزيم المستهدف أو عن طريق ربط نشاط الإنزيم بحالة الطاقة العالمية للخلية. يمكن استخدام البيولوجيا التركيبية لهندسة السلالات المناسبة للاختيار المقترن بالنمو ، وقد ركزت التطورات الحديثة على السلالات الهندسية التي تعاني من نقص في الحالات المؤكسدة أو المختزلة لأزواج العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال ، والتي يمكن أن تكون بمثابة منصات هندسة الإنزيمات. قد يؤدي استخدام هذه المنصات إلى تسريع تطوير المحفزات الحيوية والعمليات الحيوية المحسنة.

فوائد اقتران النمو عن طريق تضافر العامل المساعد

فوائد استخدام العامل المساعد auxotrophy كطريقة اختيار لهندسة الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي لبعض المواد الكيميائية ، مثل الدهون أو الوقود الحيوي أو الغازات أو المذيبات العضوية أو المركبات البوليمرية. يوفر هذا النهج العديد من الفوائد الفريدة ، بما في ذلك القدرة على اختيار المنتج المطلوب بشكل مستقل عن الركيزة أو المنتج محل الاهتمام ، مما يسهل اكتشاف النشاط الأنزيمي المحسن ، وتقديم قراءات للكشف عن النشاط الأنزيمي المحسن. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام العوامل المساعدة auxotrophs كمنصات اقتران النمو مفيد لأن الطبيعة المنتشرة في كل مكان للعوامل المساعدة للأكسدة والاختزال في التمثيل الغذائي الميكروبي تعني أن الاستراتيجيات الهندسية يمكن أن تكون قابلة للنقل أفقيا إلى الميكروبات الأخرى ذات الأهمية ، ويمكن هندسة الإنزيمات مباشرة داخل بيئة المضيف الميكروبي المطلوب. (كما هو موضح في الشكل 1)

الشكل 1: مقارنة بين العديد من تقنيات الغربلة / الاختيار المستخدمة على نطاق واسع لهندسة الإنزيمات

الطفرات ناقصة في أكسدة NADH

يمكن أن تحدث أكسدة NADH في الإشريكية القولونية من خلال طريقين ، اعتمادا على توافر الأكسجين. في ظل الظروف الهوائية ، يتأكسد NADH بشكل أساسي من خلال التنفس لتوليد ATP ، بينما في الظروف اللاهوائية ، يمكن أكسدته من خلال مسارات التخمير لإنتاج اللاكتات والإيثانول. تم استخدام سلالات متحولة من الإشريكية القولونية ، غير قادرة على استخدام مسارات التخمير المختلطة لأكسدة NADH أثناء النمو اللاهوائي ، لدفع مسارات مؤكسدة NADH للتوليف اللاهوائي للمواد الكيميائية المختلفة ، مثل 2-methylpropan-1-ol و 2،3-butanediol و 1-butanol و L-alanine. كما تم استخدام هذه السلالات الطافرة لهندسة الإنزيمات من خلال استغلال مبادئ الأكسدة والاختزال المماثلة ، مما أدى إلى تحسين المتغيرات. يمكن استخدام السلالات الناتجة لهندسة إنزيمات ومسارات أخرى تعتمد على NAD (P) H.

نقص الطفرات في الحد من NAD+  

أنشأ Wenk et al. سلالة E. coli عن طريق حذف جين ديهيدروليبويل ديهيدروجيناز (LPD) ، مما أدى إلى عدم قدرة السلالة على توليد طاقة مخفضة (NADH و NADPH) من استقلاب الأسيتات بسبب عدم وجود نشاط هيدروجيناز البيروفات. تسبب هذا في أن تظهر السلالة auxotrophy لتقليل الطاقة عند زراعتها هوائيا على الأسيتات كمصدر وحيد للكربون. (كما هو موضح في الشكل 2) كانت السلالة قادرة على النمو على الأسيتات عند استكمالها بركائز تحلل السكر العلوي أو عند التعبير عن نازعة هيدروجين فورمات أو إيثانول أو ميثانول تعتمد على NAD + مع ركائزها الخاصة. لم يتم استخدام السلالة لهندسة الإنزيم وتم تقييمها فقط من أجل تضافر العامل المساعد للأكسدة.
 

الشكل 2: الأيض المركزي 

نقص الطفرات في أكسدة NADPH

هناك استراتيجيتان مختلفتان لتحفيز NADP + auxotrophy في الإشريكية القولونية ، بالاعتماد على هندسة مسار تحلل السكر للإفراط في إنتاج NADPH. تتضمن الإستراتيجية الأولى حذف جين gapA الأصلي والتعبير عن إنزيم GAPDH غير المتجانس المعتمد على NADP + ، بينما تتضمن الإستراتيجية الثانية إعادة توجيه تدفق الكربون عبر مسار فوسفات البنتوز. السلالات الناتجة غير قادرة على النمو على الجلوكوز ولكنها تظهر نموا في ظروف مختلفة ، حيث تنمو السلالة الأولى في ظل الظروف اللاهوائية والثانية في ظل الظروف الهوائية مع الجلسرين كركيزة. تستخدم هذه السلالات لهندسة الإنزيمات ذات الخصائص المحسنة ، بما في ذلك خصوصية الركيزة والنشاط الحفاز والثبات الحراري.

نقص الطفرات في الحد من NADP +

تم تصميم ثلاث بكتيريا مختلفة ، E. coli و P. putida و C. glutamicum ، لتكون NADPH-auxotrophic ، مما يعني أنها تتطلب NADPH خارجي المنشأ للنمو. في حالة الإشريكية القولونية و C. glutamicum ، تم التخلص من الإنزيمات الأيضية المركزية لتجنب تقليل NADP + عندما تم توفير الجلوكوز كمصدر للكربون ، بينما في P. putida ، تم استخدام الهندسة بمساعدة CRISPR / nCas9 لتعطيل مجموعات من الجينات المستهدفة بالتتابع لفهم مشاركتها في استقلاب الأكسدة والاختزال. ثم تم استخدام سلالات NADPH-auxotrophic لهندسة الإنزيم المقترن بالنمو بناء على خصوصية العامل المساعد. أسفرت جولة واحدة من الطفرات باستخدام الإشريكية القولونية عن نازعة هيدروجين الفورمات المعتمدة على NADP + الأكثر كفاءة وتحديدا حتى الآن ، بينما تمثل P. putida و C. glutamicum السلالات الأولى من أنواعها التي يمكن استخدامها لهذا النوع من الهندسة.

نقص الطفرات في الحد من NMN+

تم تطوير نظام اختيار مقترن بالنمو لربط دورة العامل المساعد والنمو بناء على نقص في تقليل NMN +. تم استخدام سلالة E. coli SHuffle ، والتي تحمل عمليات حذف في جينين متورطين في إنتاج الجلوتاثيون المختزل. تم تطوير اختزال الجلوتاثيون المعتمد على NMNH من خلال الطفرات المنطقية لربط العملية بدورة NMN + / NMNH ، وتم استخدام نازعة هيدروجين الجلوكوز المعتمدة على NMN + لدعم دورة العامل المساعد NMN + / NMNH وبالتالي النمو. طبقت الدراسة أيضا تضافر العامل المساعد للأكسدة والاختزال غير المتعارف عليه لهندسة الإنزيم المقترن بالنمو لأول مرة ، مما أدى إلى متغير نازعة هيدروجين الفوسفيت القابل للحرارة مع تحسين الكفاءة التحفيزية والاستقرار الزمني في المختبر. يوفر العمل سلالة مفيدة لهندسة الإنزيم المقترنة بالنمو ، والتي تعتمد على دورة NMN+/NMNH والتغذية الذاتية للحالة المخفضة لعامل أكسدة واختزال غير قانوني.

عملت إمكانات اقتران النمو عبر العوامل المساعدة للأكسدة والاختزال كأداة قوية لهندسة المحفزات الحيوية ، لا سيما في سياق الإنتاج الحيوي المستدام. على الرغم من إحراز تقدم كبير في توليد سلالات أكسودوك أكسودروفيك ، يشير البيان إلى أنه لا يزال هناك العديد من السبل غير المستكشفة للبحث. يتضمن أحد هذه العوامل هندسة سلالات التغذية الذاتية للكائنات الحية بخلاف الإشريكية القولونية ، والتي يمكن أن تفتح إمكانيات جديدة لهندسة الإنزيمات المقترنة بالنمو.

وعموما، فإنه يشير إلى أن استخدام اقتران النمو القائم على عامل الأكسدة والاختزال يمثل فرصة كبيرة للتحفيز الحيوي الهندسي، وخاصة لإنتاج المنتجات التي لا يمكن أن تلبي متطلبات النهج الهندسية الأخرى للإنزيم عالي الإنتاجية. ويشدد على الحاجة إلى تطوير محفزات أحيائية أكثر تنوعا وكفاءة من أجل الإنتاج الأحيائي المستدام ويؤكد أهمية مواصلة البحوث في هذا المجال.


المرجع: Jochem R. Nielsen a ، Ruud A. Weusthuis b ، Wei E. Huang a ، هندسة الإنزيم المقترنة بالنمو من خلال التلاعب بتجديد العامل المساعد للأكسدة والاختزال ، تقدم التكنولوجيا الحيوية ، 2023.