هندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو من خلال التلاعب بتجديد عوامل الأكسدة الاختزاز

يتم الآن إنتاج مجموعة متزايدة من المواد الكيميائية من المواد الخام المتجددة عبر وسائل التكنولوجيا الحيوية. تعتمد العمليات الحيوية بشكل كبير على التحفيز الإنزيمي لإنتاج هذه المركبات بكفاءة. لذلك، فإن ضمان أداء الإنزيمات بشكل مثالي في بيئتها المطلوبة أمر ذو أهمية كبيرة للإنتاج المستدام.

خصائص مثل خصوصية الركيزة، ومعدل التحفيز، والاستقرار (الحراري) هي من بين عدة عوامل حاسمة يجب تحسينها لعمليات حيوية فعالة مدفوعة بالإنزيمات. قد يكون هذا التحسين مستهلكا للوقت ومكلفا وتحديا، وبالتالي فإن الطرق الفعالة والفعالة من حيث التكلفة من المرجح أن تكون للاختيار المرتبط بالنمو، حيث تطلب الإنزيمات الهندسية ذات الخصائص المرغوبة بشدة.

مزايا استخدام الانتقاء المرتبط بالنمو كشكل من أشكال اختيار الإنزيم، والذي يتضمن ربط نشاط الإنزيم بنمو الخلية. يمكن استخدام هذه الطريقة كاستراتيجية اختيار عالية الإنتاجية، ويمكن تحقيقها إما بضمان اعتماد النمو على تخليق المنتج بواسطة الإنزيم المستهدف أو بربط نشاط الإنزيم بالحالة الطاقية العالمية للخلية. يمكن استخدام علم الأحياء التركيبي لهندسة سلالات مناسبة للاختيار المرتبط بالنمو، وقد ركزت التطورات الحديثة على هندسة السلالات التي تفتقر إلى الحالات المؤكسدة أو المختزلة لأزواج عوامل الأكسدة الاختزالية، والتي يمكن أن تعمل كمنصات هندسة إنزيمات. قد يسرع استخدام هذه المنصات تطوير المحفزات الحيوية المحسنة والعمليات الحيوية.

فوائد اقتران النمو عبر تعزيز العامل المساعد

فوائد استخدام الزيادة في العوامل المساعدة كطريقة اختيار لهندسة الإنزيمات المشاركة في التخليق الحيوي لبعض المواد الكيميائية، مثل الدهون، الوقود الحيوي، الغازات، المذيبات العضوية، أو المركبات البوليمرية. يقدم هذا النهج عدة فوائد فريدة، منها القدرة على اختيار المنتج المطلوب بشكل مستقل عن الركيزة أو المنتج المطلوب، مما يسهل اكتشاف النشاط الإنزيمي المحس، ويوفر قراءة للكشف عن النشاط الإنزيمي المحسن. بالإضافة إلى ذلك، فإن استخدام المضافات المضادة للنمو مفيد لأن الطبيعة الشاملة لعوامل الأكسدة والاختزالية في الأيض الميكروبي تعني أن استراتيجيات الهندسة يمكن نقلها جانبيا إلى ميكروبات أخرى مهتمة، ويمكن هندسة الإنزيمات مباشرة داخل بيئة المضيف الميكروبي المطلوب. (موضح في الشكل 1)

الشكل 1: مقارنة بين عدة تقنيات فحص/اختيار مستخدمة على نطاق واسع في هندسة الإنزيمات

الطفرات التي تعاني من نقص في أكسدة NADH

يمكن أن يحدث أكسدة NADH في الإشريكية القولونية عبر مسارين، وذلك حسب توفر الأكسجين. في الظروف الهوائية، يتم أكسدة NADH بشكل رئيسي من خلال التنفس لتوليد ATP، بينما في الظروف اللاهوائية يمكن أكسدته عبر مسارات التخمير لإنتاج اللاكتات والإيثانول. تم استخدام سلالات الطفرة من الإشريكية القولونية، غير القادرة على استخدام مسارات التخمير المختلطة لأكسدة NADH أثناء النمو اللاهوائي، لدفع مسارات أكسدة NADH لتخليق المواد الكيميائية اللاهوائية مثل 2-ميثيلبروبان-1-أول، 2،3-بيوتانيديول، 1-بيوتانول، وإل-ألانين. كما استخدمت هذه السلالات الطفرة لهندسة الإنزيمات من خلال استغلال مبادئ الأكسدة المماثلة، مما أدى إلى تحسين المتحورات. يمكن استخدام السلالات الناتجة لهندسة إنزيمات ومسارات أخرى تعتمد على NAD(P)H.

الطفرات التي تعاني من نقص في تقليل NAD+  

أنشأ وينك وآخرون سلالة الإشريكية القولونية عن طريق حذف جين ديهيدروليبويل ديهيدروجيناز (LPD)، مما أدى إلى عدم قدرة السلالة على توليد طاقة اختزال (NADH وNADPH) من عملية استقلاب الأسيتات بسبب غياب نشاط ديهيدروجينازات البيروفيت. هذا تسبب في إظهار التضخم الإضافي لتقليل الطاقة عند زراعته هوائيا على الأسيتات كمصدر كربون وحيد. (موضح في الشكل 2) تمكن السلالة من النمو على الأسيتات عند تغذيتها بالركائز الجليكوليتية العليا أو عند التعبير عن ديهيدروجيناز الهيدروجيناز المعتمد على NAD+ من فورمات أو إيثانول أو ميثانول مع ركائزها الخاصة. لم تستخدم السلالة في هندسة الإنزيمات وتم تقييمها فقط لزيادة الأكسدة المضافة للاختزال.
 

الشكل 2: الأيض المركزي 

الطفرات التي تعاني من نقص في أكسدة NADPH

هناك استراتيجيتان مختلفتان لتحفيز NADP+ الأكستروفية في الإشريكية القولونية، تعتمد على هندسة المسار الجليكوليكي لإنتاج NADPH بشكل مفرط. تتضمن الاستراتيجية الأولى حذف جين gapA الأصلي والتعبير عن إنزيم GAPDH غير متجانس يعتمد على NADP+، بينما تتضمن الاستراتيجية الثانية إعادة توجيه تدفق الكربون عبر مسار فوسفات البنتوز. السلالات الناتجة غير قادرة على النمو على الجلوكوز لكنها تظهر نموا في ظروف مختلفة، حيث تنمو السلالة الأولى في ظروف لاهوائية والثانية في ظروف هوائية مع الجلسرون كركيزة. تستخدم هذه السلالات في هندسة إنزيمات ذات خصائص محسنة، بما في ذلك خصوصية الركيزة، والنشاط التحفيزي، والاستقرار الحراري.

الطفرات التي تعاني من نقص في تقليل NADP+

تم تعديل ثلاث بكتيريا مختلفة، الإشريكية القولونية، P. putida، وC. glutamicum، لتكون NADPH-auxotrophic، أي أنها تحتاج إلى NADPH خارجي للنمو. في حالة الإشريكية القولونية وC. glutamicum، تم استبعاد الإنزيمات الأيضية المركزية لتجنب انخفاض NADP+ عندما تم توفير الجلوكوز كمصدر للكربون، بينما في P. putida، تم استخدام هندسة بمساعدة CRISPR/nCas9 لتعطيل مجموعات من الجينات المستهدفة بشكل متسلسل لفهم دورها في استقلاب الأكسدة والاختزال. ثم تم استخدام السلالات المضادة للتغذية النارية في هندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو بناء على خصوصية العوامل المساعدة. أسفرت جولة واحدة من الطفرات باستخدام الإشريكية القولونية عن أكثر أنواع ديهيدروجيناز الشكل المعتمد على NADP+ كفاءة وتحديدا حتى الآن، بينما تمثل P. putida وC. glutamicum أول سلالات من نوعهما يمكن استخدامها لهذا النوع الهندسي.

الطفرات التي تعاني من نقص في تقليل NMN+

تم تطوير نظام اختيار مرتبط بالنمو لربط دورة العوامل المساعدة والنمو بناء على نقص في تقليل NMN+. تم استخدام سلالة إشريكية قولونية SHuffle، التي تحمل حذف في جينين يشاركان في إنتاج الجلوتاثيون المختزل. تم تطوير إنزيم جلوتاثيون ريدوكتاز معتمد على NMNH من خلال الطفرات العقلانية لربط العملية بدورة NMN+/NMNH، واستخدم ديهيدروجيناز جلوكوز المعتمد على NMN+ لدعم دورة العوامل المضافة NMN+/NMNH وبالتالي النمو. كما طبقت الدراسة الأكسدة غير التقليدية لزيادة الأكسدة المزدوجة في هندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو لأول مرة، مما أدى إلى متغير ديهيدروجيناز الفوسفيت المستقر حراريا مع كفاءة تحفيزية محسنة واستقرار زمني في المختبر. يوفر العمل سلالة مفيدة لهندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو، تعتمد على دورة NMN+/NMNH وأكسوتروفية للحالة المخفضة لعامل أكسدة غير قانوني.

وقد عملت إمكانية الاقتران بالنمو عبر عوامل الأكسدة المحازلة كأداة قوية لهندسة المحفزات الحيوية، خاصة في سياق الإنتاج الحيوي المستدام. على الرغم من إحراز تقدم كبير في توليد سلالات الأكسدة الزائدة ذات التغذية الزائدة، إلا أن البيان يشير إلى وجود عدة طرق بحثية غير مستكشفة. واحدة من هذه العوامل تتضمن هندسة سلالات مضافة للتغذية المضافة لكائنات أخرى غير الإشريكية القولونية، مما قد يفتح آفاقا جديدة لهندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو.

بشكل عام، يشير إلى أن استخدام اقتران النمو القائم على الأكسدة والاختزاز يمثل فرصة كبيرة للتحفيز الحيوي الهندسي، خاصة لإنتاج منتجات لا تستطيع تلبية متطلبات أساليب هندسة الإنزيمات عالية الإنتاجية الأخرى. يؤكد على ضرورة تطوير محفزات حيوية أكثر تنوعا وكفاءة للإنتاج الحيوي المستدام، ويؤكد أهمية استمرار البحث في هذا المجال.


المصدر: جوكيم ر. نيلسن أ، رود أ. ويوستويس ب، وي إي. هوانغ أ، هندسة الإنزيمات المرتبطة بالنمو من خلال التلاعب بتجديد عوامل الأكسدة الاختزالية، بيوتكنولوجي أدفانسز، 2023.